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本试剂盒适用于从各种原代或传代细胞和各种实体组织(如脑、脊髓、神经结或纤维、脂肪、肝脏、消化道、肾脏、心脏、肌肉、血管、结缔组织等动物组织)中提取细胞核的膜蛋白。本试剂盒含有的独特配方能有效溶解细胞核膜组份，本试剂盒含有的蛋白酶抑制剂混合物能有效阻止蛋白酶对蛋白的降解，以保障提取高纯度的蛋白。

本试剂盒提取的蛋白为具有天然构象的活性蛋白，可用于Western Blotting、蛋白电泳、免疫沉淀、ELISA、转录活性分析、Gel shift凝胶阻滞实验、、酶活性测定等下游蛋白研究实验。

本试剂盒中不含有EDTA，与金属螯和层析等下游应用兼容。本试剂盒提取的蛋白含高浓度盐成分，不可直接用于2D电泳，如下游实验需要直接用于等电聚焦、双向电泳，请使用其他货号试剂盒。也可将最后样品除盐后再用于2D电泳，可用蛋白脱盐柱脱盐处理(HR0389)。

• 蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2～8℃保存，开盖使用后-20℃保存。
  
• 蛋白酶抑制剂在2～8℃低温时是固体状态，从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。

• 使用方便，从细胞中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
  
• 将蛋白提取的时间缩短至1小时。
  
• 含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
  
• 紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
  
• 蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂；每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

• 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 实验中的所有试剂须预冷，所有器具须放-20℃冰箱预冷，整个过程须保持样品处于低温。
  
• 蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
  
• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
  
• 提取液B在使用前需一直置于2～8℃，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 膜蛋白电泳时Loading Buffer应该避免煮沸。
  
• 膜蛋白电泳时可以提高Loading Buffer的SDS含量。

• 提取准备：
  每500μL冷的提取液A和B中分别加入2μL蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
  注：
  ● 根据需处理的样品量准备蛋白提取液，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次性全部加入提取液。
  ● 加过蛋白酶抑制剂的提取液一周内未用完，再次用前需重新加入蛋白酶抑制剂。
  
• 取5～10×10⁶个细胞，在4℃，500×g条件离心2～3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
  注：由于核膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率，因此在条件允许的条件下，尽可能加大细胞量。
  
• 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
  
• 细胞沉淀中加入400μL冷的提取液A，高速涡旋振荡15秒，置2～8℃条件振荡15～30分钟。
  注：
  ● 提取液A处理后细胞体积应减小，否则延长提取液A振荡处理时间。
  ● 使用振荡器或摇床的较低转速，保持提取液可轻微晃动即可。
  ● 没有振荡条件也可不振荡，稍微延长提取液处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在4℃，10000×g条件下离心5分钟。弃上清，留沉淀。
  
• 在沉淀中加入300～500μL冷的提取液B，高速涡旋振荡15秒，充分混匀。
  注：
  ● 每次的裂解液用量并不是一定的，请根据实际情况调整。
  ● 由于核膜蛋白含量较少，需要较多的细胞才能保证得率，因此在条件允许的条件下，尽可能加大细胞量。
  ● 提取液B在使用前需一直置于2～8℃，否则下游膜蛋白提取时会导致不容易分层。
  
• 置2～8℃条件下振荡20～30分钟。
  注：
  ● 此步骤必须在2～8条件下振荡。
  ● 使用振荡器或摇床的较低转速，保持提取液可轻微晃动即可。
  ● 无振荡条件也可不振荡，置2～8℃静置，稍微延长提取液处理时间，中间每隔几分钟用移液器吹打混匀。
  
• 在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
  
• 将上清吸入另一干净的离心管，在37℃水浴10分钟。
  
• 在37℃，1000×g离心5分钟。此时溶液分为两层，下层是核膜蛋白约为30～50μL。
  注：
  ● 此步骤必须在37℃条件下离心。
  ● 没有37℃离心条件的也可以不离心，稍微延长37℃水浴时间，至液体澄清，分层清晰。
  
• 此时溶液分为两层，小心吸掉上层，留着备用分析，分离出管底部下层大约30～50μL液体。
  注：
  ● 下层为核膜蛋白。
  ● 下层为粘稠状液体。
  ● 待下游目的核膜蛋白试验完成后再丢弃上层部分。核膜蛋白萃取不完全时此上次部分蛋白仍可以进行再次提取核膜蛋白。
  
• 用50～200μL冷的溶解液C稀释该下层核膜蛋白部分，即得细胞核膜蛋白样品。
  注：
  ● 膜蛋白比较难溶解，不能很快溶解混匀，可以在加入溶解液后稍微吹打混匀，然后置于4℃冰箱静置溶解。中途用移液器轻轻吹打混匀一次，静置后取出再次用移液器稍微吹打混匀即可。
  ● 静置直至管底透明胶状物完全溶解。
  
• 将上述蛋白提取物定量后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验。
  注：
  ● 建议用BCA法进行蛋白定量。
  ● 蛋白样品-80℃存放一年没有问题，注意不要被蛋白酶水解掉，不要被细菌污染。

• 蛋白浓度低？
  膜蛋白丰度比较低，在条件允许的情况下，需要尽可能加大细胞的上样量以提高膜蛋白浓度。
  处理部分组织样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。
  
• 用什么方法定量蛋白？
  建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。
  
• 提取的蛋白具有活性吗？
  本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。
  
• 膜蛋白电泳没有条带？
  膜蛋白样品通常浓度较低，电泳前一定要进行蛋白定量，以保证电泳是蛋白上样量足够。膜蛋白提取好后，用溶解液充分溶解后，可超声处理一下，再进行蛋白定量。
  蛋白加Loading Buffer后可以不用煮沸，采用50℃保温30分钟。
  蛋白Loading Buffer中SDS终浓度含量可以提高至3%～10%。
  有些样品的膜蛋白含量太低，可以使用丙酮沉淀膜蛋白，再使膜蛋白溶解于上样缓冲液中，一般可以跑出清晰的蛋白条带。
  电泳时最好采用低电压低电流电泳。